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生物样品的常用分析方法

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  体内药分专题之五—— 生物样品常见分析方法 报告人:程 成员: 黄雪丽 陈玉宇 龚心实 崔宏霞 姜翠翠 姚路路 杜 薇 苏浩明 李 耕 徐一松 张再平 王阿琴 冯颖淑 金玉婷 露 LOGO 思考 1.在体内药物分析中所采用的生物 样品有哪些? 2.最常用的生物样品是什么? 3.药物分析中常见分析方法包括哪 些?哪些适用于体内药物分析? 生物样品的常用分析方法 体内药物分析是借助于现代化的仪器 与技术来分析药物在体内数量与质量的变 化,以获得药物在体内的各种药代动力学 参数、代谢方式、代谢途径等信息。目前, 用于生物样品分析的方法有很多,归纳起 来主要有以下几类: 。 生物样品的常用分析方法 1. 色谱分析法 2. 光谱分析法 3. 免疫分析法 4. 微生物分析法 5. 电化学分析法 www。themegallery。 色谱分析法 制作PPT者:杜 薇 查 资 料 者: 陈玉宇 苏浩明 色谱法(chromatography) 一种物理或化学的分离分析方法,其分 离原理主要是利用物质在流动相和固定相 中的分配系数,或吸附能力的差异而达到 分离。 包括薄层色谱(TLC),纸色谱(PC),凝 胶色谱,气相色谱(GC)和液相色谱(LC)。 com LOGO 薄层色谱法 (thin layer chromatography ) 是以涂布于支持板上的支持物作为固定相, 以合适的溶剂为流动相,对混合样品进行 分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。 根据不同的分离机制,薄层色谱法可分为 吸附薄层色谱、分配薄层色谱、离子交换 薄层色谱和凝胶薄层色谱法等。 www。themegallery。 LOGO 薄层色谱法 (thin layer chromatography ) 分离速度快 优点 检出灵敏度高 选择性好 显色方便等 缺点:对生物高分子分离效果不甚理想。 www。themegallery。 薄层扫描法 (TLCS) 系指用一定波长的光照射在薄层板上,对薄 层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射 能激发产生荧光的斑点进行扫描,将扫描得 到的图谱及积分值用于药品的质量检查的方 法。 与高效液相色谱法相比,具有多通道效应, 可同时平行分离分析多个样品;流动相用量 少且选择范围宽、更换方便;固定相为一次 性使用,对样品的预处理要求不高等优点。 已成为薄层色谱常用的定量方法,在体内药 物分析中广泛应用。 www。themegallery。 薄层扫描法 (TLCS) 实例:薄层扫描色谱法检测血清中对乙酰氨基酚 采用TLCS法检测患者血清中对乙酰氨 基酚的浓度,为临床急诊中毒分析和血药浓 度监测提供了快速简便的方法。 该法板间测定误差小、回收率高、线 性范围宽,能准确测定患者血药浓度。与文 献报道的HPLC和GC法相比,具有简便快 速、样品用量少、费用低和不需要进行衍生 化等优点 。 www。themegallery。 气相色谱法 (gas chromatography,GC) 定义:以气体为流动相的的色谱法称为气相 色谱法。 分类: 按固定相的聚集状态:GSC、GLC 按分离原理:GSC属于吸附色谱、GLC 属于分配色谱 按色谱操作形式:填充柱气相色谱、毛细管 柱气相色谱。 www。themegallery。 气相色谱法 (gas chromatography,GC) 优点 1.效能高 neff可达103-106。 2.灵敏度高 检测限可达纳克级或更低。 3.选择性高 固定相对性质极为相似的组分, 如烃类异构体等有较强的分离能力。 4.分析速度快 一般的气相色谱分析一次仅 需几分钟。 5.应用范围广 气相色谱法广泛应用于气体 和易挥发性物质或可转化为易挥发性物质的 生物样品的定性和定量分析。 www。themegallery。 气相色谱法 (gas chromatography,GC) 缺点: 要求被测药物及其代谢物必须具有一定的 挥发性和热稳定性。 解决方法: 固定相发展和衍生化试剂的广泛使用,使 生物样品不再受限制。 www。themegallery。 气相色谱法 (gas chromatography,GC) 实例:气相色谱法测定中毒病人血液中的溴氰菊酯 方法: 样品加入乙腈、涡旋混合、超声提取 、 Florisil固相萃取柱净化、氮吹,DB-17 石英弹性毛细管柱30m(0. 32mm ,0.25 μ m) 分离,气相色谱电子捕获检测器(GC-ECD)检 测, 保留时间定性,外标法定量。 结果: 方法最低检出限为0.01 ng/ml,样品加 标回收率为80.1%~94.5%, 相对标准偏差 (RSD)为2.3%~4.8%。 www。themegallery。 气相色谱 法 (gas chromatography ,GC) 结论: 该方法简便、快速、准确,检出限 低,适合中毒病人血液中溴氰菊酯含量的测 定。 www。themegallery。 高效液相色谱法 定义 以经典液相色谱为基础,以微粒型填 料作固定相,采用高压送液泵和各种高灵敏度 检测器。 分离效能高 优点 检测灵敏度高等 分析速度快 选择性好 适用范围广 www。themegallery。 高效液相色谱法 缺点 有“柱外效应”。在从进样到检测器 之间,除了柱子以外的任何死空间(进样器、 柱接头、连接管和检测池等)中,如果流动 相的流型有变化,被分离物质的任何扩散和 滞留都会显著地导致色谱峰的加宽,柱效率 降低。 高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。 www。themegallery。 高效液相色谱法 液-固吸附色谱法 液-液分配色谱法 离子交换色谱法 分 离 方 法 凝胶排阻色谱法 www。themegallery。 高效液相色谱法 色谱分离方法的选择 主要根据是样品的相对分子质量 的大小,在水中和有机溶剂中的溶解 度,极性和稳定程度以及化学结构等 物理、化学性质。 www。themegallery。 高效液相色谱法 一、相对分子质量 对于相对分子质量较低(一般在200以 下),挥发性比较好,加热又不易分解的样 品,可以选择气相色谱法进行分析 。 相对分子质量在200~2000的化合物,可 用液-固吸附、液-液分配和离子交换色谱法。 相对分子质量高于2000,则可用空间排阻色 谱法。 www。themegallery。 高效液相色谱法 二、溶解度 水溶性样品最好用离子交换色谱法和液液分配色谱法; 微溶于水,但在酸或碱存在下能很好电 离的化合物,也可用离子交换色谱法; 油溶性样品或相对非极性的混合物,可 用液-固色谱法。 www。themegallery。 高效液相色谱法 三、化学结构 若样品中包含离子型或可离子化的化合 物,或者能与离子型化合物相互作用的化合 物(例如配位体及有机螯合剂),可首先考 虑用离子交换色谱,但空间排阻和液-液分 配色谱也都能顺利地应用于化合物;异构体 的分离可用液-固色谱法;具有不同官能团 的化合物、同系物可用液-液分配色谱法; 对于高分子聚合物,可用空间排阻色谱法。 www。themegallery。 高效液相色谱法 高效液相色谱法串联紫外- 荧光检测器同时测定 ? 人血浆中对乙酰氨基酚与盐酸曲马多的浓度 www。themegallery。 流动相,紫外- 荧光检测器串联法同时在线检 测对乙酰氨基酚与曲马多,紫外检测波长: 245 nm;荧光激发波长: 275 nm,发射波长: 304 nm。20名健康志愿者服药后,依据血浆中 对乙酰氨基酚与曲马多经时血药浓度,对2种 制剂进行了生物等效性研究。 结果:本法中对乙酰氨基酚最低定量限为 0.110μg/mL,线μg/mL ,日内RSD为3.9% ~8.0% , 日间RSD为5.5% ~6.7%;曲马多最低定量限 www。themegallery。 为10.03 ng/ml,线 ng/mL,日内RSD为1.9% ~5.9% ,日间RSD 为3.4% ~7.3%。受试制剂中对乙酰氨基酚的 相对生物利用度为(96.1 ±15.0) % ,曲马多的 相对生物利用度为(93.9 ±15.3) %。 结论:本方法操作简便、灵敏度高,可用于临床 血药浓度测定。受试制剂与参比制剂生物等效 。 www。themegallery。 胶束电动毛细管色谱(MECC) 在MECC体系中存在着以胶束形式存在的 准固定相和作为载体的液体流动相,胶束带电 荷在电场的作用下产生泳动,溶质中各组分依 据其在水相和胶束相之间的分配差异及在电泳 和电渗流驱动下出现淌度差异而分离。 优点:手性拆分常用的分离模式之一,只需在 背景电解质中添加手性选择剂,构建手性环境, 即可进行手性拆分,本法适用于拆分人体内的 氨基酸。 www。themegallery。 胶束电动毛细管色谱(MECC) ? www。themegallery。 涡流色谱技术(TFC) 涡流色谱技术是利用大粒径填料使流动 相在高流速下产生涡流状态,从而对生物样 品进行净化与富集。 优点: 可以在线处理生物样品,速度快、选择 性好、灵敏度高,易于实现自动化,近年来 在生物领域尤其是体内药物分析中得到了广 泛的应用。 参考文献:涡流色谱技术在生物样品分析中的应用 刘朋,周建良,安婧婧,李萍,Chinese Journal of Chromatography www。themegallery。 光谱分析法 制作PPT者:姚路路 查 资 料 者:李 耕 徐一松 冯颖淑 光谱法(Spectroscopy) 光谱法是基于检测能量(电磁辐射) 作用于待测物质后产生的辐射信号或所 引起的变化的分析方法。 特点 www。themegallery。 LOGO 应用于体内药物分析的光谱法 比色法(COL) 紫外分光光度法(UV) 荧光分析法(Fluorescence method) 原子吸收分光光度法(AAS) www。themegallery。 一.比色法(COL) 主要用于药物监测 属于吸收光度法 和人群代谢分型的 定量依据---Lambert-Beer定律 测定,逐渐被现代 A=ECL 色谱分析方法所取 代。 物质在一定波长处的吸收度与其浓度 成正比。比色法仅用于少数药物浓度高, 干扰成分少的生物样品的测定。 www。themegallery。 紫外分光光度法(UV) 原理同比色法。适用于测定具有紫外 吸收的药物。 体内药分中母体药物与代谢物的紫外 吸收光谱非常相似,易产生干扰。受灵敏 度和选择性的限制,其在体内药分中的应 用也呈下降趋势。 www。themegallery。 荧光分析法 (Fluorescence method) 利用物质经光照射后能发射荧光的特性 进行分析的光学分析法。 优点: 1.灵敏度高。检出限可达10-10 g/ml~10-12g/ml。 2.选择性好。 www。themegallery。 荧光分析法 (Fluorescence method) (一)常规荧光分析法 1.直接测定法 适于自身能产 生荧光的物质,因 荧光性质与溶液的 pH有关,故荧光强 度的测定须在适宜 的pH介质中进行。 2.间接测定法 将无荧光或 弱荧光物质衍 生化,测定衍 生物荧光强度 的方法。 www。themegallery。 荧光分析法 (Fluorescence method) (二)胶束增溶增敏荧光分析法 利用胶束溶液对荧 光物质的增溶、增 敏和增稳作用,大 大提高荧光分析法 的灵敏度和稳定性。 用β-CD单分子胶束荧光技术 检测秦艽中龙胆苦苷血药浓 度。 龙胆苦苷嵌入β-CD的疏 水空洞中,使其在胶束中溶 解度增加和相互碰撞几率减 少,荧光量子效率提高,从 而提高检测灵敏度。 www。themegallery。 荧光分析法 (三)荧光探针分析法 (Fluorescence method) 局限 衍生化增加分析 步骤,易引入分析 使用荧光探针从无荧光的药物制备有荧光 误差。 的衍生物。 优点 1 2 3 增强待分析 物质的荧光 响应,提高 检测灵敏度 和选择性。 稳定分析物, 有助于化合 物基团的确 尤其针对活 证。 泼的和有挥 发性的化合 物。 www。themegallery。 荧光分析法 (Fluorescence method) 示例 Tb-吡哌酸的荧光体系及尿和血清中 吡哌酸含量的测定 应用镧系离子发光探针生成Tb-吡哌酸配 合物,在紫外光照射下发生分子内能量传 递使Tb产生特征荧光,其荧光强度与吡哌 酸浓度呈线性关系,从而建立一种灵敏、 快速的分析吡哌酸的方法。 www。themegallery。 荧光分析法 (Fluorescence method) (四)荧光淬灭分析法 待分析的物质能使某种荧光化合物的荧 光淬灭,通过测量荧光化合物荧光的下降, 间接测量该分析物质。 www。themegallery。 原子吸收分光光度法(AAS) 原子吸收分光光度法是基于蒸汽相中 被测元素的基态原子对其原子共振辐射的 吸收来测定样品中该元素含量的一种方法。 原子吸收分光光度法在测定体液中微 量金属元素方面占有特殊的地位。 www。themegallery。 原子吸收分光光度法(AAS) 优点: 灵敏度高,精密度好,选择性好,应用范围 广,试样用量少,简便快速,易于自动化。 局限性: 1.该法只能进行无机元素的含量分析,不能 直接用于有机化合物的含量分析和结构分 析; 2.每测一种元素要更换一次空心阴极灯,不 能同时进行元素分析; 3.标准工作曲线的线性范围窄,一般为一个 数量级。 www。themegallery。 原子吸收分光光度法(AAS) 原子吸收分光光度计主要部件: 光源(空心阴极灯) 原子化器 单色器 检测系统 www。themegallery。 原子吸收分光光度法(AAS) 光源 单色器 样品 a 检测器 读出器件 光电倍增管 原子化器 空心阴极灯 单色器 b 样品 读出器件 吸收光谱仪 www。themegallery。 原子吸收分光光度法(AAS) 直接测定法 石墨炉原子吸收法测定大鼠血清、尿、胆 汁和组织中的顺铂 间接测定法 尿样中氨基多糖含量的测定 www。themegallery。 免疫分析法 制作PPT者:黄雪丽 查 资 料 者:姜翠翠 崔宏霞 张再平 免疫分析法 放射法免疫分析 按标记物的种类 酶免疫分析法 RIA EIA 方法分类 方 法 分 类 按是否加入分离剂 化学发光酶免疫分析法 CLIA 荧光免疫分析法 FIA 均相免疫分析 ---EMIT、FPIA 非均相免疫分析 www。themegallery。 放射免疫分析法 (radioimmunoassay) 原理:放射性标记抗原和未标记抗原(待 测物)与不足量的特异性抗体竞争性地结 合,反应后分离并测量放射性而求得未标 记抗原的量。用反应式表示为: Ag + Ab=Ag-Ab + Ag* Ag*-Ab www。themegallery。 放射免疫分析法 (radioimmunoassay) 优点: 1 灵敏度高 2 特异性强 3 取样量少,适用于大批量样品的测定 www。themegallery。 放射免疫分析法 (radioimmunoassay) 缺点: 1 需要用放射性同位素标记抗原,其放射性对操作 人员的健康、对环境的污染都会造成危害。 2 有时会出现交叉反应、假阳性反应。 3 需要有专用的同位素实验室及免疫测定 仪器。 www。themegallery。 放射免疫分析法 (radioimmunoassay) 应用实例 最典型的例子是: 地高辛的血药浓度测定 www。themegallery。 酶免疫分析法 (enzyme Immunoassay) 酶免疫 分析法 均相EIA 非均相EIA www。themegallery。 均相EIA 测定原理:竞争性结合分析 特点:不必将结合部分与游离部分分开, 不需温育,可直接用分光光度法 测定其吸收度。 www。themegallery。 非均相EIA ? www。themegallery。 酶联免疫吸附测定(ELISA) 原理: 将特异的抗原- 抗体免疫学反应和酶催化 反应相结合,以酶促反应的放大作用来显 示初级免疫反应。 www。themegallery。 酶联免疫吸附测定(ELISA) ELISA是通过在合适的载体上,酶标限 定量抗原与未知抗原竞争固相抗体结合位点 或固相抗原与未知抗原竞争限定量的标记抗 体结合位点,形成抗体复合物。在一定底物 参与下,复合物上的酶催化底物,使其水解、 氧化或还原成另一种带色物质。由于酶的降 解底物与显色是成正比的,通过肉眼观察或 分光光度计测定,从而确定是否存在未知抗 原或含量。 www。themegallery。 酶联免疫吸附测定(ELISA) ▲应用实例: 《酶联免疫分析法及其在食品农药残留检测 中的应用》武中平,徐春祥等 酶免疫分析法检测肝肾胰岛细胞移植患者 术后CSA浓度的临床评价 温冬梅 ,梁剑平 ,吴剑杨 ,庞嘉琳 ,李曼 www。themegallery。 酶免疫分析法 (enzyme Immunoassay) EIA优点: 1 酶标记物是非放射性同位素,可避免对人体 的放射性伤害和对环境的污染。 酶标记物比较稳定,半衰期可超过一年。 2 3 反应不需温育,均相EIA不需分离直接测定。 反应可用可见-紫外分光光度法测定。 4 www。themegallery。 酶免疫分析法 (enzyme Immunoassay) EIA缺点: 标记酶不能像同位素标记物和 荧光标记物那样直接产生信号, 须有其他试剂(酶底物、辅酶) 的参与,才能完成酶反应。 www。themegallery。 化学发光免疫分析(CLIA) 化学发光免疫分析(CLIA) 化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫 反应系统和化学发光分析系统。 化学发光分析系统: 经催化剂的催化和氧化剂的氧化→激发 态的中间体→光子→发光信号→光量子 产额。 免疫反应系统:类似于抗原与抗体。 www。themegallery。 化学发光免疫分析(CLIA) 按发光剂不同分为: 直接化学发光物质标记法(CLIA ) 化学发光酶免疫分析法(CLEIA) 电化学发光免疫分析法(ECLIA) www。themegallery。 化学发光免疫分析(CLIA) 应用实例 ●吕干新、何伟珍等人《化学发光免疫分析 法测定地高辛血药浓度结果分析》 ●钟筑宁、谷俊莹等人《化学发光免疫分析 法与放射免疫分析法测定性激素的评价》 www。themegallery。 荧光免疫分析FIA 是以荧光物质作为标记物与待测药物结 合,所形成的荧光标记物能与抗体发生免疫 反应 ,引起荧光强度发生变化的一种分析方 法。 按产生荧光的方式不同 1.底物标记荧光免疫分析 2.荧光偏振免疫分析 3.荧光淬灭免疫分析 4.荧光增强免疫分析 5.时间分辨荧光免疫分析 www。themegallery。 底物标记荧光免疫分析(FPLA) 用一种本身不能发出荧光的酶底物来 标记药物,当酶底物受到相应酶作用时,能 裂解产生荧光,其荧光强度与待测药物含量 成正比。 www。themegallery。 荧光偏振免疫分析( FPIA) 用一定波长的激发偏振光照射荧光物 质,然后利用物质吸收光能后所发射出的 偏振荧光强度来测定样品中待测组分含量 的一种分析方法。 www。themegallery。 荧光偏振免疫分析( FPIA) 目前应用最多的是FPIA,是一种新型 的竞争性免疫分析方法 相对于传统的酶联吸 附免疫分析 (ELISA) ,FPIA是均相的反 应体系,不需要分离结合和未结合的抗体, 方法学评价如下张,其已在药物检测领域得 到了初步应用,主要用于测定药物,激素等 物质,是用于治疗药物监测的最新检测技术。 www。themegallery。 荧光偏振免疫分析( FPIA) 荧光偏振免疫测定方法评价: 样品用量少 荧光偏振 免疫测定 方法评价 荧光素标记试剂稳定,使用寿命长 重复性好 快速,易自动化 适于小、中等分子物质检测 灵敏度较非均相荧光免疫测定法低 www。themegallery。 荧光淬灭免疫分析FQIA 是利用游离标记药物具有荧光,当其 与抗体结合之后即失去荧光这一性质来测 定样品含量的一种荧光分析方法。 www。themegallery。 荧光增强免疫分析FEIA 是利用荧光标记药物与抗体结合之后, 能使其荧光强度增强的性质来测定样品的含 量。 www。themegallery。 时间分辨荧光免疫分析TRFIA TRFIA 技术是以镧系元素为示踪剂, 用具有双功能基团的镧系元素标记抗原或抗 体,当与抗体或抗原结合时,抗原抗体复合 物在增强液中解离,在特定激发光激发下发 出特定波长的荧光。用时间分辨荧光仪测定 复合物中稀土离子发射的荧光强度,从而确 定待测样品中抗原或抗体的浓度值,以达到 定量分析的目的。 www。themegallery。 时间分辨荧光免疫分析TRFIA 与以往的放射免疫分析法相比,镧系元 素具有以下特点:激发光谱带宽,可以增加 激发能,提高灵敏度;发射光谱带窄,减少 非特异荧光,可有效降低本底荧光,且能量 损失也不大;镧系离子鳌合物的荧光寿命很 长,镧系离子由激发态跃迁到基态时发射荧 光,在测量时间内可反复激发镧系离子,相 当于大大提高了标记比活性;标记物比较稳 定,可以保存1-2年。 www。themegallery。 时间分辨荧光免疫分析TRFIA 应用举例: 李慧萍、段巧艳 《时间分辨荧光免疫分析 法检测乙型肝炎病毒血清标志物研究》 国内最常用的HBV感染者的血清学标志 物检测主要依靠酶联免疫吸附试验 (ELISA),它只能对HBV 血清学标志物 做定性或半定性分析,而且操作过程中受多 种因素影响。ELISA 检测结果准确度降低, www。themegallery。 时间分辨荧光免疫分析TRFIA 甚至出现假阳性、假阴性结果。尤其目前 ELISA 法不能用于定量测定,局限了其应 用。 TRFIA 灵敏度高,特异性强,对于乙 型肝炎两对半定量检测,能够准确、及时、 灵敏地反映患者体内的HBV 病毒标志物的 含量。 www。themegallery。 微生物分析法 制作PPT者:黄雪丽 查 资 料 者:王阿琴 微生物测定法 (microbiological analysis,MA) 为生物检定法,它是利用药物(常为 抗生素)对于微生物的抑制或杀灭作用,通 过选择对药物敏感的试验菌,在适当的条件 下,根据培养基上所产生的抑菌圈的大小来 测定药物效价的方法。 通过研究抑菌圈直径与抗菌素浓度的 关系来测定生物样品中药物浓度。 www。themegallery。 微生物测定法 微生物 测定法 稀释法(见下图) 比浊法 扩散法 www。themegallery。 微生物测定法 稀释法 www。themegallery。 微生物测定法 比浊法 将抗生素标准品的稀释液和供试品的稀 释液分别加入试管中,加入已接种试 验菌的 液体培养基,根据抗生素的浓度不同,实验 菌受抑制的程度也不同,因而产生不同程度 的浑浊,从而计算出供试品的效价。 www。themegallery。 微生物测定法 扩散法 又叫琼脂扩散法,它是以琼脂作 为固体培养基,利用抗生素在琼脂培 养基内的扩散作用,将标准品溶液与 供试品溶液加到接种了敏感菌的同一 培养基上,恒温培养一定的时间,比 较标准品与供试品对试验菌所产生的 抑菌圈的大小,计算出供试品的浓度 。 www。themegallery。 微生物测定法 使用范围 优点 缺点 一般用于抗生素, 也可用于某些抗 癌药物、维生素 和氨基酸等的测 定。 ?具有灵敏度高、需 样量较小、无需特 殊设备的优点,不 但适用于较纯的原 料药物、制剂,也 适用于经过简单提 取分离的生物样品 的分析。 ?操作步骤多、 测定时间长、 误差较大。 www。themegallery。 微生物测定法 应用: 目前,微生物测定法已为世界各国公认, 被列入各国药典,《中国药典》附录简述了 生物检定的统计方法。 1.血清中司帕沙星微量微生物测定法 2.环丙沙星浓度微生物测定法的建立 3.β-内酰胺酶抑制剂舒巴坦含量的微生物测 定法 www。themegallery。 电化学分析法 制作PPT者:程 露 查 资 料 者:金玉婷 龚心实 电化学分析法 是一类基于电池内发生电化学反应 而建立的分析方法。 一般是根据待测物溶液的电化学性 质,选择适当的电极组成化学电池,通 过测定电信号强度或其变化对被测组分 进行定性定量分析。 由于受到方法灵敏度和选择性的限 制,在体内药物分析中应用不多。 Thank You ! www。themegallery。com

2021-11-28 05:02:00
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