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生物样品分析方法的基本要求

来源:环球体育官方首页

  第四节 生物样品分析方法的基本要求 在测定生物样品中药物及其代谢 物时,一般要在测定前进行样品的前 处理,即进行分离、纯化、浓集。 一、常用品种的种类、采集和贮 藏 生物样品包括各种体液和组 织,常用是血液(血浆、血清、 全血)、尿液、唾液。 (一)血样 血浆(plasma)和血清(serum)是 最常用的生物样品。 测定血中药物浓度通常是指测定血 浆或血清中的药物浓度,而不是指含有 血细胞的全血中的药物浓度。 一般认为,当药物在体内达到稳定 状态时,血浆中药物浓度与药物在作用 点的浓度紧密相关,即血浆中的药物浓 度反映了药物在体内(靶器官)的状况, 因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度 的可靠指标。 1.取样: 供测定的血样应能代表整个血药 浓度,因而应待药物在血液中分布 均匀后取样。 动物实验时,可直接从动脉或 心脏取血。 对于病人,通常采取静脉血, 有时根据血药浓度和分析方法灵敏 度。也可用毛细管采血。 2.制备: 血浆的制备 将采取的血液置 含有抗凝剂(如:肝素、草酸盐等) 的试管中,混合后,离心,分离血 细胞,上清液即为血浆。 肝素是一种含硫酸盐的粘多糖,常用 其钠盐、钾盐,它能阻止凝血酶原转化为 凝血酶,从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋 白。一般lml的全血需加0.1—0.2mg的肝素, 加入血样后立即轻轻旋摇,但勿太猛烈, 以免导致血细胞破裂。 血清的制备 血清是由血液中纤 维蛋白原等影响下,引起血液凝结 而析出的澄清黄色液体,经离心其 量约为全血量的30%一50%。在室 温高时,血凝过程进行得很快,宜 在血凝后半小时内分离血清。当室 温低时,血凝过程较慢,可将血液 置37℃温度下加速血清析出。 血浆及血清中的药物浓度测定 值通常是相同的。 全血也应加入抗凝剂混匀, 防止凝血。对大多数药物来说血 浆浓度与红细胞中的浓度成正比, 所以测定全血也不能提供更多的 数据。由于全血的净化较血浆和 血清麻烦,特别是溶血后,血色 素等可能会给测定带来影响。 3.特点: 血样的采取量受到限制、间隔时 间,采集方法:一般取1ml—2m1。用 注射器、毛细管或微量采血管采取。 血样的采血时间间隔应随测定目的的 不同而异。 采取血样后,应及时分离血浆或 血清,并立即进行分析。如不能立即 测定时,应完全密塞后保存,短期冷 藏(4℃),长期冷冻(-20℃)保存。 (二)唾液 唾液的采集应尽可能在刺激少 的安静状态下进行。一般在漱口后 15min收集。 采集后立即测量其除去泡沫部 分的体积。放置后分为泡沫部分、 透明部分及灰乳白色沉淀部分三层。 分层后离心分离,取上清液作为药 物浓度测定的样品。 可集中、单一部位采集。 唾液中含有粘蛋白,为阻止粘 蛋白的生成,应将唾液在4℃以下 保存,解冻后搅匀后再用,否则会 产生误差。 优点:可以不受时间和地点的 限制,很容易地反复采集,采集时 无痛苦无危险;有些唾液中药物浓 度可以反映血浆中游离型药物浓度。 缺点: 唾液是各腺体分泌的的混合液体,其 组成发生经时变动;因此,唾液中的药物 浓度与血浆中的游离型药物浓度相比就容 易变动; 唾液中药物浓度与血浆中药物浓度的 比值(S/P)只有少数药物是恒定值; 有些与蛋白结合率较高的药物,药物 在唾液中的浓度比血浆浓度低得多,需要 高灵敏度的分析方法才能检测; 对有些患者(如癫痛二昏迷)不能采 集唾液样品。 (三)尿液 尿药测定主要用于药物剂量回收研 究、尿清除率、生物利用度的研究。 体内药物清除主要是通过尿液排出, 药物可以原型(母体药物)或代谢物及 其缀合物(conjugates)等形式排出。 尿液主要成分是水、含氮化合物 (其中大部分是尿素)及盐类。 尿液中药物浓度较高,收集量 可以很大,也方便,但尿液浓度通 常变化较大,应测定一定时间内排 入尿中药物的总量,这就需要测定 在规定时间内的尿液体积及尿药浓 度,时间尿以外的尿不可能推断全 尿中药物的排泄浓度和药物总量。 测定尿中药物的总量时,将一 定时间内(如8h;12h或24h等)排 泄的尿液全部储存起来,并记录其 体积,取其一部分测定药物浓度, 然后乘以尿量求得排泄总量。采集 的尿液时,需用量筒准确地测量储 尿量,并做好记录。 缺点:尿液中药物浓度与血药浓度 相关性差;受试者的肾功能正常与否直 接影响药物排泄,因而肾功能不良者不 宜采集尿样;婴儿的排尿时间难于掌握; 尿液不易采集完全并不易保存。 采集的尿样应立即侧定。若收集24h 的尿液不能立即测定时,应加入防腐剂 置冰箱中保存。常用防腐剂有:甲苯等, 短时冷藏;长时冷冻。 二 生物样品分析其前处理技术 主要应考虑生物样品的种类,被测 定药物的性质和测定方法三个方面的问 题。 样品的分离、纯化技术应该依据生 物样品的类型。例如,血浆或血清需除 蛋白,使药物从蛋白结合物中释出;唾 液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白; 尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀 合物中释出。 根据被测定药物的结构、理化性 质及药理性质、存在形式、浓度范围 等,采取相应的前处理方法。 87页图4-4大致反映了检测方法与 样品前处理要求的相互关系。 (一)去除蛋白质 目的: 可使结合型的药物释放出来, 以便测定药物的总浓度; 去除蛋白质也可预防提取过程 中蛋白质发泡,减少乳化的形成, 以及可以保护仪器性能,延长使用 期限。 去除蛋白质方法: 1.加入与水相混溶的有机溶剂 加 入水溶性的有机溶剂,可使蛋白质的分 子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白 质凝聚,使与蛋白质结合的药物释放出 来。常用的水溶性有机溶剂有:乙睛、 甲醇等。含药物的血浆或血清与水溶性 有机溶剂的体积比为1:(1-3)时,就可 以将90%以上的蛋白质除去,采用超速离 心机(10000r/min )离心便可将析出的 蛋白质完全沉淀。 2.加入中性盐 使溶液的离子 强度发生变化。中性盐能将与蛋白 质水合的水置换出来,从而使蛋白 质脱水而沉淀。 常用的中性盐:饱和硫酸胺等。 盐析的方法与有机溶剂提取法常并 用,药物的回收率高。 3.加入强酸 当pH低于蛋白质 的等电点时,蛋白质以阳离子形式 存在,加入强酸,可与蛋白质阳离 子形成不溶性盐而沉淀。常用的强 酸有:10%三氯醋酸等。含药物血 清与强酸的比例为1:0.6混合,高 速离心,就可除去蛋白质,取上清 液作为样品。在酸性下分解的药物 不宜用本法除蛋白。 4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 当pH高于蛋白质的等电点时,金属 阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的 羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的 沉淀剂有:CUS04-Na2W04 ,ZnS04NaOH等。含药物血清与沉淀剂的比 例为1:2混合,高速离心、分离后 得上清液。 5.酶解法 在测定一些酸不稳定及蛋白结 合牢的药物时,常需用酶解法。最 常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌 溶素。 (二)缀合物的水解 尿中药物多数呈缀合状态。 含羟基、羧基、氨基和巯基的 药物。可与内源性物质葡萄糖醛酸 形成葡萄糖醛酸苷缀合物; 含酚羟基、芳胺及醇类药物与 内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。 由于缀合物较原型药物具有较 大的极性,不易被有机溶剂提取, 常用酸水解或酶水解的方法。 酸水解时,可加入适量的盐酸 液。 对于遇酸及受热不稳定的药物, 可以用酶水解法。常用葡萄糖醛酸 苷酶或硫酸酯酶或葡萄糖醛酸苷酶 一硫酸酯酶的混合酶。 (三)分离、纯化与浓集 1.液~液提取法(liquidliquid extraction; LLE)多数药物 是亲脂性的,在适当的有机溶剂中 的溶解度大于在水相中的溶解度, 而血样或尿样中含有的大多数内源 性杂质是强极性的水溶性物质。因 而用有机溶剂提取一次即可除去大 部分杂质。 应用本法时要考虑所选有机溶剂的 特性、有机溶剂相和水相的体积及水相 的pH值等。 对所选用的有机溶剂,要求对被测 组分的溶解度大:沸点低,易于浓集、 挥散;与水不相混溶以及无毒、化学稳 定、不易乳化等。最常用的溶剂是 和氯仿等。 提取时所用的有机溶剂要适量。一 般有机相与水相(体液样品)容积比为1: 1或2:1。 生物样品一般多在碱性下提取, 多数药物是亲脂性的碱性物质,生 物样品中的内源性物质多是酸性的。 当碱性药物在碱性pH不稳定时, 则在近中性pH处用氯仿和异丙醇提 取。 提取时于水相(体液样品)中加入 有机溶剂后,一般只提取一次。如有必 要还须将第一次提取分离出的含药物有 机相再用一定pH的水溶液反提取(back extraction),然后再从水相将药物提 取到有机相。 液-液提取法的优点在于它的选择性, 这是依赖于有机溶剂的选择。极性大的 药物使用离子对试剂(ion pair reagent)的离子对提取法(ion pair extraction method)。 2.液-固提取法(liquid-solid extraction,LSE)也为一种柱色谱法。 将具有吸附、分配及离子交换性质的、 表面积大的担体作为萃取剂填入小柱, 以溶剂淋洗后,将生物样品通过,使 其药物或杂质保留在担体上,用适当 溶剂洗去杂质,再用适当溶剂将药物 洗脱下来。 LSE具有优点:LSE较少引入杂 质;消除了LLE的主要缺陷—乳化 现象;提取效率高,可用少量生物 样品进行分析;柱为可弃型,废弃 物易从实验室移走;在最后洗脱中 多数采用以水为主的溶剂系统,大 大增加了安全性;最大的优点为处 理样品速度快,并在室温下操作, 尤其适于处理挥发性及对热不稳定 的药物。 常用于填充柱的担体大致分为 两类: 1.亲水性的硅藻土,有机溶 剂冲洗药物 2.疏水活性炭、聚苯乙烯或 C18化学键合硅胶,吸附亲酯性 药物,然后用有机溶剂分离药 物。 3.被测组分的浓集的方法: 末次提取时加入的提取液尽量 少,然后直接测定。 氮气流吹干 减压法挥去溶剂 (四)化学衍生化 分离前将药物进行化学衍生化 的目的是:①使药物变成具有能被 分离的性质②提高检测的灵敏度③ 增强药物的稳定性;④提高对光学 异构体分离的能力等。 药物分子中含有活泼H者均可被 化学衍生化,如含一COOH、-OH、NH2、-NH-、-SH等官能团的药物都 可被衍生化。 1.GC中化学衍生化法 药物的化学衍生化前处理对GC 十分必要,衍生化可使药物分子中 的极性基团,如羟基、氨基、羧基 等变成无极性的、易于挥发的药物, 从而使GC温度不必很高即可适合GC 分析要求,主要的衍生化反应有烷 基化(alkylations)、酰化 (acylations)、硅烷化 (silylations)等。其中以硅烷化 用得最广泛。 常用的烷基化试剂:碘庚烷、 叠氮甲烷、氢氧化三甲基苯胺 (TMAH)等; 常用的酰化试剂:乙酸酐、丙 酸酐等; 硅烷化试剂:三甲基氯硅烷 (咖CS)、双-三甲基硅烷乙酰胺 (BSA)、双-三甲基硅烷三氟乙酰 胺(BSTFA)、三甲基硅烷咪唑 (IMTS)等。 具有光学异构体药物的分离 也可采用不对称试剂,使其生成 非对映异构体衍生物,然后用GC 法或HPLC法进行分析测定。常用 的不对称试剂有:(S)-N-三氟 乙酰脯氨酰氯、(S)-N-五氟乙 酰脯氨酰氯等。 2. HPLC中化学衍生化法 衍生化的目的是为了提高药 物检测灵敏度。 化学衍生化包括柱前衍生化 和柱后衍生化两种方法。 柱前衍生化分析前尽可能将药物 进行精制后再衍生化。 柱后衍生化是药物经色谱柱分离 之后进行的,所以可形成对检测器具 有高灵敏度的衍生物,从而提高了选 择性。HPLC法常用的衍生化试剂有邻 苯二醛、丹酰氯、荧胺等。 三、生物样品定量分析方法验证 (一)特异性 证明所测定的物质是原形药物或 特定的活性代谢物 (二)标准曲线与线性范围 回归方程相关系数r≥0.9900。在线 性范围内浓度测定结果应达到试验要求 的精密度和准确度。 (三)精密度与准确度 药典附录《药物制剂人体生物利 用度和生物等效性试验指导原则》规 定考察3个浓度的精密度和准确度。 一般RSD应小于15%,在LOQ附近 RSD应小于20%。 批内精密度:是同一次测定的 精密度。所得RSD应争取达到5% 以内,但不能超10%。 批间精密度:是不同次测定的 精密度。所得RSD应控制在15%以 内。 回收率一般应在85%-115% 范围内,在LOD附近应在80%一 120%范围内。 (四)最低定量限 最低定量限LOQ至少能满足测定3 -5 个半衰期时样品中的药物浓度或Cmax的 1/10一1/20时的药物浓度。 (五)样品稳定性 在室温、冰冻和冻融条件下以及不同 存放时间进行稳定性考察,以确定生物样 品的存放条件和时间。 (六)提取回收率 绝对回收率 考察高、中、低3个浓度的提 取回收率,它是预处理(提取)过 程的回收率,反映出样品预处理过 程中组分丢失的情况,是评价萃取 方案优劣的指标之一,一般低于 100%,但是重现性要好。 (七)质控样品 质控样品系将已知量的待测药 物加入到生物介质中配制的样品, 用于质量控制。 (八)质量控制 分析方法确证后开始测试未知 样品。每批生物样品测定时应建立 新的标准曲线,并平行测定高、中、 低3个浓度的质控样品。质控样品测 定结果的偏差一般应小于20%。

2021-11-28 04:50:17
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