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实验室微生物样品收集与保存攻略 (一)

来源:环球体育官方首页

  由于处理和存储样品的变化会影响研究结果,因此要想维持在现场收集样品的完整性也是微生物研究中的一项重大挑战。

  生物通报道:过去十年间,科学家们花费数十亿美元完成了人体、土壤和海洋等不同地点的微生物的分类归总,通过日益精确的新一代测序技术,我们对这些差别甚大的微生物有了更多的认识,比如说,对细菌核糖体小亚基 16S rRNA 编码基因进行高通量测序,科学家们能了解样品中的微生物多样性。此外还可以选择鸟枪宏基因组学作为互补技术,分析样品中所有生物的所有基因。这些DNA测序技术十分敏感,也能识别样品污染和危害样品处理引发的细微变化。

  由于处理和存储样品的变化会影响研究结果,因此要想维持在现场收集样品的完整性也是微生物研究中的一项重大挑战。

  来自Mayo医院的微生物生态学家 Vanessa Hale表示,金标准方法是从新鲜样本中立即提取DNA 或 RNA。当不可能立即处理的时候,最好能将样品储存在80°C。室温下粪便样品中的微生物组成会在一到两天内发生转变,其它样品,如土壤也同样具有温度敏感性。

  但是超低温冰箱并不是随取随到的,也许粪便样本首先在家里收集得到,或者研究人员需要从很远的地方收集土壤样品。在一些情况下,样品都需要存储和保留几天或几周,才能进行DNA和 RNA的提取和分析。

  来自芝加哥大学的微生物生态学家 Jack Gilbert说,“微生物多样化多到可怕,而且复杂。任何特殊处理都会改变其组成部分。”不过随着技术发展,现在可以进行更多深入的微生物群落分析,即使是微生物菌群最小的变化或者相对丰度改变,也会极大的干扰群体比对,因此储存方法引起的变化越小越好。以下是The Scientist杂志推荐的一些样品保存技巧。

  原始样品的保真性从收集样品的那一刻就开始了。第一步需要确保你获得的是一个均匀的样品,“如果一个样品不是均质样品,那么首先要使之均质化,”来自比利时根特大学的微生物学家Kim Heylen说,“如果你想要重复性好的样品,那么(这样做)至关重要。”

  美国加州大学戴维斯分校的微生物学家Holly Ganz在一家非盈利机构KittyBiome进行野猫和家猫的微生物组研究,他们一般采集野猫和家猫的粪便作为样品,她说,“粪便当然不是均质的,因此这就产生了一个问题:采用哪一部分的粪便会影响研究结果。”

  因此Ganz需要均质化样品,她首先去除了粪便的外层,这一部分可能包含有环境污染物,然后剩余部分放置到塑料袋中进行人工碾磨和混合。之后Ganz又将样品铺开,收集二次样品,“要让粪便样品均质化并不容易,所以我只好增加二次取样的次数,”她说。

  土壤样品具有更加复杂的组分,Gilbert建议将土壤样品放到搅拌机中,充分搅碎颗粒物。他说,“不可能完全均质化。”

  此外,研究人员也建议在初次收集样品后再进行多次等分分装,因为多次反复冻融会破坏核酸,这一点其实很多实验室研究人员都知道。比如研究人员可以采用无菌一次性活检钳(biopsy punch)从一个更大的原始样品中收集几乎相同大小的冻存粪便颗粒,然后直接将这些颗粒放入含有核酸裂解液中的提取管中。这种方法就是对原始样品进行等分,但可以为科学家们节约整整一次冻融重复循环。

  美国福赛思研究所、麻省综合医院(MGH)和哈佛大学公共卫生学院等处的科学家,开发出一种新的方法,用于收集用于基因组和转录组分析的唾液与粪便。该方法不需要专业人员和设施,同时还能保持样品的完整性。

  这种方法可让受试者在家里收集微生物样品,然后运至实验室进行多种类型的分子分析。尽管采用不同的取样方法,微生物种类、基因和基因转录组成,在所有样品中都是一致的。随后就对这些样品进行的分析显示,测量的人类微生物组的功能潜力和功能活性之间存在的异同点。

  所谓低温冻存保存剂(cryopreservant)是指帮助特定样品稳定核酸成分的缓冲液,也就是一种低端技术冷冻保存的方法。低温冻存保护剂能保护细胞免受由于凝固温度冰块形成和温度波动所导致的机械伤害。

  低温冻存保存剂也很多种,如甘油就能避免水结冰产生冰晶损伤细胞。要选择哪一种,这取决于你的研究项目和样品需求。

  如果你想要培养细菌或者需要微生物保持活性,那么就可以考虑选择甘油,这种化合物能在低至零下20-80度的温度下防止冰晶形成,因此我们实验室中不少菌种保存采用的是甘油。

  OpenBiome是麻省的一家非盈利性粪便库,收集健康人的粪便样品,用于治疗感染艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)的患者。艰难梭状芽孢杆菌是一种常见的厌氧细菌,会产生肠毒素和细胞毒素,导致住院病人腹泻。人们通常认为,艰难梭菌的感染主要是在医院环境下传播的。

  由于粪便移植治疗的成功取决于存在活的细菌,因此粪便样品需要与含有12.5%甘油的盐溶液混合,这样才能在20°C下保存六个月,80 °C保存两年。

2021-12-09 02:45:10
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